一、 前 言
近二十幾年來(lái)，免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標(biāo)記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來(lái)許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫（RIA）分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的生物催化作用，一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報(bào)道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。
ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于研究標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：
1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。
2、研究抗酶抗體的合成。
3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。
4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
二、方法的基本原理和種類
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；
（2）抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；
（3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。
由于ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個(gè)方面。
（一）測(cè)定抗原的，主要有四種方法。
1、競(jìng)爭(zhēng)法（Competition method）:方法的基本原理可見(jiàn)圖1：本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個(gè)過(guò)程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測(cè)定的未知抗原的量。
這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可，因此，對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類的測(cè)定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)保溫洗滌過(guò)程。但需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點(diǎn)。
圖1：竟?fàn)幏y(cè)抗原示意圖
2、雙抗體夾心法
方法的基本原理可用圖2來(lái)表示
圖2.雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖
本法首先也是用特異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。
這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定。HbSAg及HbS的測(cè)定。
3、改良雙抗體夾心法：本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測(cè)定抗原的，其原理可用圖3來(lái)表示。
圖3.改良雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖
本法首先是將特異性抗體a包被于固相載體，經(jīng)洗滌加入含有欲測(cè)抗原之待檢樣品。經(jīng)孵育洗滌后再加一次未標(biāo)記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于*次包被于固相載體上的特異性抗體a對(duì)被測(cè)抗原來(lái)說(shuō)都是特異性的，但不是用同種動(dòng)物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。經(jīng)孵育洗滌后，再加酶標(biāo)記抗b抗體，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色進(jìn)行測(cè)定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時(shí)避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。
用于測(cè)定抗原的尚有第4種叫做抑制性測(cè)定法（見(jiàn)圖4），它是先用抗原包被固相載體，然后分為二組，一組加入用參考抗體和被檢標(biāo)本混合孵育后的混合溶液，假如標(biāo)本中不含抗原，則參考抗體未被結(jié)合。因此它可以和包被于固相載體上的抗原結(jié)合。如標(biāo)本中含有抗原，則抗原先與參考抗體結(jié)合，故參考抗體不再與包被于固相載體上的抗原結(jié)合。對(duì)加入酶結(jié)合物（抗球蛋白）和底物僅顯示剩余結(jié)合的抗體量。再與另一組不加待檢標(biāo)本的參考系統(tǒng)比較，被檢標(biāo)本對(duì)底物顯色的抑制程度與標(biāo)本中所含抗原量成比例，二者之差，即為欲測(cè)抗原的量。
圖4.抑制性測(cè)定法的原理
被檢標(biāo)本對(duì)底物顯色的抑制程度與標(biāo)本中所含抗原的量成比例，二者之差即為欲測(cè)抗原的量。
（二）測(cè)定抗體方面：所用的方法稱為間接法，也是目前zui常用的方法，其原理可用圖5來(lái)表示。
圖5.間接法測(cè)抗體示意圖
間接法首先用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，（對(duì)人的標(biāo)本來(lái)說(shuō)即加酶標(biāo)抗人球蛋白IgG、IgM），再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測(cè)抗體的量，其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人IgM,則可用于早期診斷。
三、ELISA的影響因素
這是ELISA檢測(cè)中的重要部分，可從9個(gè)方面加以說(shuō)明。
（一）固相載體：可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測(cè)定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板及塑料管。由于微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應(yīng)用。國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板（上海塑料三廠出品）目前已大量應(yīng)用于ELISA測(cè)定，并且獲得了滿意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對(duì)抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過(guò)程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至*喪失吸附能力。因此，對(duì)每批制品在使用前，必須經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室鑒定，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)每批購(gòu)置的微量反應(yīng)板或塑料管抽樣，用0.2ug/ml純化的正常人IgG進(jìn)行包被，經(jīng)洗滌后加酶標(biāo)記抗人球蛋白進(jìn)行反應(yīng)，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應(yīng)后，逐孔在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定其消光值、光密度（O.D值）。一般認(rèn)為全板中每?jī)煽组gO.D值的誤差不超過(guò)10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽(yáng)性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應(yīng)板或塑料管在使用前并不一定通過(guò)特殊處理。用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。
（二）抗原：在ELISA中，包被于固相載體表面的抗原或抗體的來(lái)源和制備方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由于抗原中所含雜質(zhì)就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應(yīng)考慮到制備包被抗原不應(yīng)破壞其免疫學(xué)活性。經(jīng)試驗(yàn)證明，適用于其他血清學(xué)試驗(yàn)的抗原并非均適合用于ELISA法。因此，對(duì)某一疾病的診斷，必須通過(guò)實(shí)踐，才能選出適用的抗原。對(duì)大多數(shù)傳染病和寄生蟲病的血清學(xué)診斷中所用的抗原并非要求十分嚴(yán)格，一般能用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細(xì)菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細(xì)菌的外毒素以及用表面活性劑（如SDS）所提取的抗原等，在作ELISA時(shí)，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表面活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表面活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。此外，對(duì)某些抗原必須進(jìn)行提純，如病毒的組織培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)物以及病毒接種動(dòng)物的臟器等，它們當(dāng)中存在著許多非抗原的蛋白質(zhì)，必須設(shè)法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經(jīng)提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時(shí)也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時(shí)選擇的濃度要適當(dāng)。如濃度太高，則低效價(jià)抗體可能測(cè)不出來(lái)，或包被過(guò)量形成多層抗原吸附，故在操作過(guò)程中可能脫落從而降低敏感性和可重復(fù)性。用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經(jīng)濟(jì)，而且可以克服前帶現(xiàn)象。那么用多大濃度抗原進(jìn)行包被zui為合適呢？可通過(guò)棋盤滴定法進(jìn)行測(cè)定，但用單項(xiàng)滴定法更為簡(jiǎn)便，其方法是將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應(yīng)板，再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌，再加酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)孵育洗滌后，加底物溶液顯色，終止反應(yīng)后分別測(cè)定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)O.D值稍大于1.0，而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。抗原包被固相載體除濃度外，對(duì)時(shí)間、溫度、PH均有關(guān)系。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時(shí)間可縮短，溫度低可延長(zhǎng)包被時(shí)間。但為了方便起見(jiàn)，通常采用4℃包被過(guò)夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應(yīng)板或塑料管作固相載體時(shí)，在堿性條件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原）4℃包被過(guò)夜較為合適。但在某些試驗(yàn)中，如用LPS或毒素蛋白包被時(shí)，用
PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質(zhì)的濃度為1-10ug/ml，而對(duì)某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應(yīng)通過(guò)滴定。
（三）試驗(yàn)樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗(yàn)樣品（標(biāo)本）。但應(yīng)注意分離血清時(shí)，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會(huì)使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關(guān)于科研血清在保存過(guò)程中抗體的穩(wěn)定性報(bào)導(dǎo)尚不多。但一般認(rèn)為作ELISA血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存于低溫冰箱，并防止反復(fù)凍融。血漿可用肝素毛細(xì)管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標(biāo)本，可用含保護(hù)性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤(rùn)劑的緩沖液來(lái)稀釋。也可加入一些蛋白質(zhì)，如1%牛血清白蛋白等來(lái)稀釋。然后再加到已經(jīng)用抗原或抗體包被的固相載體中進(jìn)行孵育。此種被試標(biāo)本可作一系列稀釋度測(cè)定，也可用一個(gè)稀釋度測(cè)定。對(duì)于作某一個(gè)傳染病的診斷來(lái)說(shuō)，先用一系列稀釋度作一批標(biāo)本測(cè)定，求出對(duì)診斷有意義的一個(gè)稀釋度（即測(cè)定劑量反應(yīng)曲線），然后用一個(gè)稀釋測(cè)定即可。zui適稀釋度和孵育時(shí)間均需從實(shí)踐中摸索出來(lái)，對(duì)一般病原微生物所引起的傳染病的血清學(xué)診斷，以1：200稀釋度測(cè)定比較適當(dāng)，而試驗(yàn)標(biāo)本的（即含抗體）作用時(shí)間一般為室溫或37℃ 1-2小時(shí)。但現(xiàn)在對(duì)有些標(biāo)本（如流腦抗原）測(cè)定時(shí)，僅用37℃ 5分鐘。對(duì)單克隆抗體檢測(cè)也可縮短作用時(shí)間。
（四）結(jié)合物：在ELISA中，用酶標(biāo)記的抗體或抗原統(tǒng)稱為結(jié)合物，此為進(jìn)行ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵試劑。常規(guī)使用ELISA法的主要問(wèn)題是能夠簡(jiǎn)便地制備酶結(jié)合物，而此種制備好的酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。
用什么樣的酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體呢？可根據(jù)以下幾點(diǎn)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)拿浮?/span>
1、酶制品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數(shù)大（即一個(gè)酶分子能催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)的酶）。
2、酶及制備好的酶結(jié)合物在檢測(cè)或貯存中能保持穩(wěn)定。
3、酶制劑易得、價(jià)廉.
4、既要適用于標(biāo)記抗原，又適用于標(biāo)記抗體，標(biāo)記后不影響抗原或抗體的免疫學(xué)特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)簡(jiǎn)便、快速。在定量測(cè)定中產(chǎn)物必須是可溶性的。
6、要有安全、價(jià)廉、易得的底物。
符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105（Alkaline Phospatase,簡(jiǎn)稱AP），辣根過(guò)氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,簡(jiǎn)稱HRP,分子量為4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（AP和HRP）zui為常用。
AP活力高，制備好的酶結(jié)合物可加NaN3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中或大腸桿菌中提取，而且價(jià)格比較昂貴。因此，目前國(guó)內(nèi)外大多使用HRP。HRP活性也高，價(jià)格較便宜。但制得酶結(jié)合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑制HRP的活性，但可作低溫保存或加60%緩沖甘油等量混合后少量分裝，保存冰箱，一般可用1-2年。
由于HRPzui為常用，故先把HRP的一般性質(zhì)介紹一下，以便在制備酶結(jié)合物時(shí)可引起注意。
（HRP的性質(zhì)）:HRP系從辣根菜的根中所提取，這種酶是無(wú)色酶蛋白與暗棕色的鐵卟
NH2
啉（E鐵血素）相結(jié)合的一種醣蛋白，可簡(jiǎn)寫成Fe-E ，由多個(gè)（6-7個(gè)）同功
CH2OH
酶所組成。分子量約為40000，等電點(diǎn)為PH7.2。能被58-62%飽和硫酸銨沉淀，在PH3.5-12均較穩(wěn)定。63℃15分鐘，室溫?cái)?shù)周、甲苯和其他苯類有機(jī)溶劑處理都不影響它的活性。
由于HRP中的酶蛋白和鐵卟啉分別在波長(zhǎng)280nm和403nm有二個(gè)zui大吸收峰，其兩者的比值，即O.D403nm/O.D280nm稱為RZ值（系由德文Reinnoit-Zah）而來(lái)，表示酶的純度。高純度酶制品RZ值可達(dá)3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高達(dá)75%。不適合作ELISA用，經(jīng)純化后才能應(yīng)用。目前我們國(guó)產(chǎn)的HRP RZ值達(dá)2.5-3.0，亦可作ELISA用。
抗體：制備酶結(jié)合物的抗體要提純。被標(biāo)記的抗體要求效價(jià)及親和力都要高，因?yàn)榧兓贵w可增加反應(yīng)的特異性。如果采用級(jí)特異性的酶結(jié)合物（例如酶標(biāo)抗IgM、酶標(biāo)抗IgG）。有助于區(qū)別活動(dòng)性感染（早期診斷）和已過(guò)性感染（追朔診斷）。但在大多數(shù)情況下，用抗血清中的蛋白成份與酶結(jié)合所制成的結(jié)合物亦可應(yīng)用，而且相當(dāng)穩(wěn)定。其方法是用硫酸銨沉淀抗血清三次（50%飽和的1次，33%飽和的2次），經(jīng)透析除鹽，即可用于標(biāo)記?；蛘呓?jīng)DEAE-纖維素柱層析后所制成的IgG亦可標(biāo)記。如將IgG再通過(guò)葡聚糖凝膠G-200膠濾（用PH7.2 PBS洗脫）所得純化IgG用HRP標(biāo)記則更佳。但損失較大，也有人用親和層析法提純抗體來(lái)標(biāo)記的。但在用酶來(lái)標(biāo)記抗體前，需測(cè)定一下抗體球蛋白效價(jià)和蛋白含量。一般用Beutner氏瓊脂糖散法測(cè)效價(jià)（即玻片雙相瓊脂擴(kuò)散法），中央孔加1mg/ml抗原，周圍孔加不同稀釋度粗制或提純抗體（馬或羊抗人IgG），室溫?cái)U(kuò)散24小時(shí)，沉淀反應(yīng)效價(jià)達(dá)到1：16以上者即可應(yīng)用。而蛋白質(zhì)含量可用751紫外線分光光度計(jì)測(cè)定，也可用Folin酚法測(cè)定。
結(jié)合：用什么樣的方法將HRP與抗體球蛋白結(jié)合起來(lái)呢？當(dāng)然不能用強(qiáng)烈的方法，因?yàn)閺?qiáng)烈的方法會(huì)使酶和抗體失去活性。故只能用溫和的方法把酶和抗體結(jié)合起來(lái)。因此，必須使用結(jié)合劑。理想的結(jié)合劑應(yīng)具備下列條件：（1）不影響酶及抗體活性，（2）不產(chǎn)生干擾物質(zhì)，（3）抗體和酶結(jié)合后應(yīng)有較高的產(chǎn)量，（4）不出現(xiàn)非特異性反應(yīng),（5）結(jié)合程序簡(jiǎn)便，（6）來(lái)源易、價(jià)廉。目前常用的有戊二醛和過(guò)碘酸鈉二種。由于對(duì)所使用結(jié)合劑的針對(duì)性，因此標(biāo)記的方法也有戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鈉氧化法兩類。
1、戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種能使蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)zui常用的雙功能試劑。它有2個(gè)對(duì)稱的活性醛基，可分別與酶蛋白和免疫球蛋白上的游離氨基（酚基、味唑基、巰基）以共價(jià)鍵邊接起來(lái)而形成的酶結(jié)合物。例如酶（Fe-E-NH2CH2OH，）通過(guò)戊二醛與免疫球蛋白（Ig-NH2）的交聯(lián)反應(yīng)式如下：
NH2 H H
Fe-E + OHC-（CH2）3-CHO + H2N-Ig--> Fe-E-N=C-（CH2）3-C=N-Ig+2H2O
CH2OH CH2OH
酶 低聚醣基團(tuán) 戊二醛 免疫球蛋白 酶結(jié)合物 水
用戊二醛標(biāo)記又可分為一步法和二步法。一步法主要是將酶、抗體球蛋白和戊二醛同時(shí)混合而直接制備。此法雖然簡(jiǎn)單，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，當(dāng)然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶標(biāo)記抗體的比例較少，同時(shí)抗體和酶的活性喪失較多，結(jié)合物的酶活性較低，但較簡(jiǎn)便。戊二醛二步法中先用過(guò)量的戊二醛與酶作用，使戊二醛上的一個(gè)活性醛基先與酶蛋白上的一個(gè)氨基結(jié)合后，除去過(guò)量戊二醛（可通過(guò)葡聚糖凝膠G-25過(guò)柱或用透析法除去），然后，再加入抗體球蛋白，使之與酶--戊二醛復(fù)合物反應(yīng)，形成酶結(jié)合物。而酶結(jié)合物的多余醛基可用加入小分子的氨基酸如賴氨酸除去，于穩(wěn)定酶結(jié)合物的特異性。在戊二醛二步法中，酶本身并不產(chǎn)生縮合，因?yàn)樵诘诙矫阜肿由系囊粋€(gè)游離氨基僅與戊二醛上的一個(gè)活性醛基聯(lián)結(jié)，而戊二醛上另一個(gè)活性醛基則可與第二步加入的抗體球蛋白分子上的氨基結(jié)合生成酶結(jié)合物，因此，兩步法優(yōu)點(diǎn)是能生成均一的酶結(jié)合物，大多可使一個(gè)分子酶與一個(gè)分子球蛋白作用，抗體和酶的活性損失較少，所得酶結(jié)合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是將10mg HRP溶于0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L PBS中，置室溫18小時(shí)，充分透析或經(jīng)葡聚糖凝膠G-25層析除去多余戊二醛，加生理鹽水至1ml，然后加入5mg純化的抗體球蛋白及0.1ml PH 9.6的1 mol/L碳酸鹽緩沖液，混合后于4℃冰箱放置24小時(shí)，加入0.1ml 0.2 mol/L的賴氨酸溶液，室溫置2小時(shí)，用PH 7.2、0.15 mol/L PBS充分透析，藉離心除去沉淀，上清即為酶結(jié)合物。必要時(shí)可作進(jìn)一步純化后使用。
2、過(guò)碘酸鈉氧化法：本法是目前酶標(biāo)記抗體較好的方法，能使70%酶與90%以上球蛋白結(jié)合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，F(xiàn)DNB）封閉HRP表面的游離氨基（亦可用甲醛或戊二醛來(lái)封閉），從而提高酶結(jié)合抗體球蛋白的能力，避免酶的自身交聯(lián)。然后用過(guò)碘酸鈉來(lái)氧化HRP表面結(jié)構(gòu)的醣鏈部份（即低聚醣基團(tuán)）使成醛基，使其直接與抗體球蛋白上的游離氨基形成共價(jià)鍵而結(jié)合。zui后用硼氫酸鈉還原，使HRP表面醛基能充分與抗體球蛋白上氨基進(jìn)行反應(yīng)，使之形成穩(wěn)定的結(jié)合物。其反應(yīng)式如下:
NH2 N=CH2
（1） Fe—E +HCHO----> Fe—E +H2O
CH2OH CH2OH
N=CH2 NaIO4 N=CH2
（2） Fe—E +O---->Fe— E + H2O
CH2OH CHO
N=CH2 N= CH2
（3） Fe—E +H2N-Ig---> Fe—E + H2O
CHO C=N-Ig
H
其標(biāo)記步驟是：10mg HRP溶于新鮮配制的0.3 mol/L PH 8.1碳酸氫鈉2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯無(wú)水乙醇溶液，室溫中攪拌1小時(shí)以封閉HRP表面的游離氨基。再加2ml 0.08 mol/L NaIO4水溶液，于室溫中輕攪30分鐘，用0.16 mol/L乙二醇溶液終止氧化反應(yīng)。1小時(shí)后移入透析袋中置0.01 mol/L PH 9.5的碳酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜，除去試劑，透析袋中的即為醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗體球蛋白（用2ml碳酸鹽緩沖液溶解），混勻，室溫?cái)嚢?-3小時(shí)后加10mg硼氫酸鈉鹽，4℃冰箱4小時(shí)或過(guò)夜。次日取出加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物（去游離酶），并用50%飽和硫酸銨洗滌1-2次。再溶于3ml PH 7.4 PBS中，并置透析袋經(jīng)透析除鹽，如有沉淀藉離心除去。上清酶結(jié)合物加入等量60%甘油PBS，分裝保存，冰箱備用。
如采用改良過(guò)碘酸鈉簡(jiǎn)化法制備酶結(jié)合物，比原法更簡(jiǎn)便、快速，所獲制品質(zhì)量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約5分鐘后加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合后，置冰箱內(nèi)20分鐘，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，30分鐘后加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無(wú)水乙醇（AR）沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇（盡量去除乙醇），沉淀用PH9.6的0.05 mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊或馬抗人IgG（內(nèi)含蛋白量20mg左右），攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過(guò)夜，次日取出加10mg NaBH4 混勻，3小時(shí)后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50%飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理鹽水透析除鹽（需換液5次），如有沉淀藉離心除去，上清呈淡棕色即為酶結(jié)合物。加60%甘油PBS，分裝保存?zhèn)溆谩?/span>
制備好的酶結(jié)合物，要作兩者克分子比和使用稀釋度的測(cè)定，標(biāo)記率的測(cè)定（A403/A280—0.4—1.0為宜）。
1、酶結(jié)合物克分子比測(cè)定：將制備好的酶結(jié)合物經(jīng)適當(dāng)稀釋在分光光度計(jì)中以280nm和403nm測(cè)O.D值，然后按下列公式計(jì)算兩者的克分子比。
（1）酶戊二醛交聯(lián)法的計(jì)算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4為酶O.D403nm=1.0時(shí)相當(dāng)于0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42為酶蛋白結(jié)合戊二醛后在280nm應(yīng)有的O.D，抗體球蛋白0.62為蛋白質(zhì)與酶--戊二醛結(jié)合后O.D280nm值約應(yīng)以加6%，故以0.94校正之。換算系數(shù)，故zui后要乘于0.62。
（2）用過(guò)碘酸納氧化法的計(jì)算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3為酶蛋白本身在280nm應(yīng)有的O.D值。
mg/ml（酶） mg/ml（球蛋白） mg（酶）×4 克分子比=---------- ÷---------------=--------------- 40000 160000 mg（球蛋白） |
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶結(jié)合物的克分子比。
一般要求制備好的酶結(jié)合物二者克分子比在0.8-1.2，但不能超過(guò)2或稍高。
2、酶結(jié)合物使用稀釋度測(cè)定：先將一定濃度的抗原（如為抗人酶結(jié)合物，則用1μg/ml正常人IgG）包被固相載體，洗滌后加一系列不同稀釋度之酶結(jié)合物進(jìn)行孵育，洗滌加底物顯色，并終止反應(yīng)。在酶標(biāo)比色計(jì)中測(cè)定不同稀釋度酶結(jié)合物的O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個(gè)酶結(jié)合物稀釋度即為本批酶結(jié)合物的使用濃度，見(jiàn)表中約1：12000稀釋。
| 酶結(jié)合物稀釋度 | 1：3000 | 1：6000 | 1：9000 | 1：12000 | 1：15000 | 1：18000 |
| O.D值 | 2.45 | 1.96 | 1.59 | 1.12 | 0.74 | 0.405 |
（五）洗滌劑與稀釋劑：為了使特異性結(jié)合的抗體量盡可能多，包被微量反應(yīng)板凹孔的抗原應(yīng)該稍微過(guò)量。但在孵育或洗滌過(guò)程中，已吸附的抗原可能有部份會(huì)從固相載體上被洗滌下來(lái)。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質(zhì)很可能會(huì)吸附到原來(lái)包被抗原凹孔的空白處,增加本底顏色,產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng),這是限制ELISA特異性的一個(gè)因素.因此不少學(xué)者在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護(hù)性阻劑來(lái)抑制非特異性蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性吸附作用。已經(jīng)證明牛血清白蛋白（BSA）和吐溫—20有良好的封阻作用。其加入的量BSA為0.5%～1%；吐溫—20為0.05%。（有人曾經(jīng)比較了四種洗滌劑，結(jié)果認(rèn)為蒸餾水加0.05%吐溫-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐溫-20都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有NaN3防腐，但是用HRP制備酶結(jié)合物時(shí)則不能加NaN3，因NaN3能抑制HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善ELISA的結(jié)果觀察，但由于BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗滌劑中加入0.1%白明膠，2%免血清，有利于加強(qiáng)封阻作用。zui近有人報(bào)告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl緩沖液中加入0.05%吐溫-20作洗滌劑，效果很好，被檢血清和酶結(jié)合物的稀釋劑，可與洗滌劑相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應(yīng)，而且還可增加陽(yáng)性標(biāo)本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質(zhì)有關(guān)。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無(wú)吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應(yīng)用。（0.5 mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀釋劑中，可提高特異性。
（六）底物：各種酶都有對(duì)底物的特異性，所以使用不同種類的酶要求有不同的底物。一旦酶結(jié)合物已經(jīng)確定（如AP或HRP），那么可供選擇底物的范圍是很有限的。在這有限底物的范圍內(nèi)如何選擇合適的底物呢？應(yīng)按下列幾個(gè)條件進(jìn)行選擇。（1）底物在未被酶催化以前應(yīng)該是無(wú)色的，而經(jīng)酶催化后有明顯的顏色變化，這樣可使結(jié)果分辨清楚；（2）所顯色澤易干洗脫；（3）顯色后的產(chǎn)物要求穩(wěn)定，在作定量測(cè)定時(shí)所產(chǎn)生的有色物質(zhì)應(yīng)該是可溶性的；（4）價(jià)廉，易得而且無(wú)毒。
因此，對(duì)AP酶結(jié)合物來(lái)講，一般均用硝基苯磷酸鹽，顯色后呈桔黃色，色澤穩(wěn)定，用2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，可用波長(zhǎng)403nm測(cè)定O.D值。AP催化底物產(chǎn)生顏色的反應(yīng)如下：
O AP R—O--P—OH+H2O R—OH+H3PO4 OH 桔黃色 對(duì)硝基酚脂肪酸 對(duì)硝基酚 |
因AP是一種磷酸酯酶,它能催化磷酸酯（硝基苯磷酸鹽）水介釋放出無(wú)機(jī)磷酸而顯色。
對(duì)HRP酶結(jié)合物來(lái)說(shuō)，主要通過(guò)酶的催化作用使過(guò)氧化氫還原。同時(shí)使另一個(gè)底物氧化產(chǎn)生色變，可供選擇的底物有幾種，過(guò)去都用5-氨基水楊酸，它經(jīng)酶催化后產(chǎn)生棕色產(chǎn)物便于觀察，缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生沉淀，用于定量測(cè)定時(shí)有困難。目前大多數(shù)使用鄰苯二胺（Ortho-Pheny lene-diamine，簡(jiǎn)稱OPD），穩(wěn)定、敏感，其降解產(chǎn)物呈桔紅色，可溶。用2 mol/L H2SO4或檸檬酸終止反應(yīng)，可在492nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)比色計(jì)上測(cè)定O.D值，也可目測(cè)。HRP在催化反應(yīng)中可使H2O2分解出新生態(tài)氧，本身還原成水，而使OPD氧化生成有色產(chǎn)物，反應(yīng)式如下：
NH2 NH NH NH2 HRP NH NH +H2O2-------> +2H2O O.P.D 桔紅色 |
O、P、D對(duì)光不穩(wěn)定，故加后需放暗處作用。但據(jù)報(bào)告有致突變性，
O.P.D對(duì)光不穩(wěn)定，故加后需放暗處作用，但據(jù)報(bào)告有致突變性，使時(shí)需注意。此外尚可選用鄰聯(lián)甲苯胺（Ortho-Toli dine，簡(jiǎn)稱OT），顯色以后呈蘭色，可用波長(zhǎng)630nm測(cè)O.D值，不需終止反應(yīng)。也可用目測(cè)，但顯色后不穩(wěn)定，40分鐘色澤會(huì)自行減退，故需及時(shí)測(cè)定結(jié)果。加終止劑后呈現(xiàn)黃色，則需用波長(zhǎng)405nm測(cè)定O.D值。
底物配制方法如下：
1、用O.P.D作底物：先配制PH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。取0.1 mol/L（19.2克/升），檸檬酸溶液24.3ml，加0.2 mol/L（27.4克/升）Na2HPO4溶液25.7ml，再加蒸餾水50ml，然后將40mgO.P.D溶解其中，再加30% H2O2 0.10ml即可應(yīng)用，用時(shí)新鮮配制、避光。
2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸鹽緩沖液，取0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸鈉（16.4克/升）溶液等量混和，然后稱取OT 21.2mg先溶于1ml二甲基乙酰胺中，再將OT溶液傾入100ml PH3.7的醋酸鹽緩沖液中，并加入30%H2O2 0.05ml即得，用前新鮮配制。
（七）作用時(shí)間：加底物后要多長(zhǎng)時(shí)間終止反應(yīng)測(cè)定結(jié)果呢？一般可采取二種方法。
1）任意確定一個(gè)時(shí)間，如20分鐘或30分鐘終止反應(yīng)，測(cè)定被檢標(biāo)本和陽(yáng)性參考標(biāo)本的O.D值。這樣所得的數(shù)據(jù)要進(jìn)行校正，校正可按下列公式：
1.0 校正后O.D值=被檢標(biāo)本的O.D值×------------------- 陽(yáng)性標(biāo)本的O.D值 |
2）制備好一批酶結(jié)合物后預(yù)試時(shí)間，在反應(yīng)溫度固定時(shí)，當(dāng)陽(yáng)性參考血清O.D值達(dá)到1.0時(shí)終止反應(yīng)，記錄這個(gè)時(shí)間，如30分鐘，以后用本批酶結(jié)合物測(cè)定待檢樣品時(shí)都采用同一時(shí)間終止反應(yīng)，這個(gè)辦法不需要校正，比較方便。
國(guó)外在使用自動(dòng)測(cè)定儀時(shí)，加底物后隨時(shí)測(cè)定，每塊試驗(yàn)板上陽(yáng)性參考血清的O.D值，當(dāng)其達(dá)到1.0時(shí)，立即將全板上被試標(biāo)本終止反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，這樣所得結(jié)果比較一致。我國(guó)也有自動(dòng)酶標(biāo)測(cè)定儀，但由于固相載體不夠均勻，也很難用板來(lái)直接測(cè)定。
在ELISA中所加酶結(jié)合物之濃度，加后孵育時(shí)間以及加底物后孵育時(shí)間。這三個(gè)因素也是互相有影響的。一般講，酶結(jié)合物濃度低，則要求孵育時(shí)間長(zhǎng)些，而酶結(jié)合物濃度高則要求孵育時(shí)間短些，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況，變更不同因素，以取得良好的結(jié)果。
由于ELISA中變異因素多，對(duì)于要診斷某一疾病時(shí)，必須進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)室預(yù)試，摸索，或叫實(shí)驗(yàn)研究，在酶結(jié)合物已經(jīng)確定的情況下，一般要求預(yù)測(cè)以下5個(gè)條件：
（1）抗原包被濃度；
（2）被檢血清稀釋度，即測(cè)劑量反應(yīng)曲線；
（3）*抗體作用時(shí)間；
（4）酶結(jié)合物作用時(shí)間；
（5）底物作用時(shí)間。
一旦試驗(yàn)條件摸清，以后在正式測(cè)定時(shí)，必須固定條件，不要隨時(shí)改變，以使試驗(yàn)系統(tǒng)保持足夠的穩(wěn)定性。
（八）結(jié)果判斷:ELISA的試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，也可用分光光度計(jì)作測(cè)定。當(dāng)然,后者更為正確。而肉眼觀察更為簡(jiǎn)便，而且也有一定正確性。據(jù)Adler（1980）報(bào)告,目測(cè)為±1+、2+、3+、4+相當(dāng)于分光光度計(jì)測(cè)定O.D值。
不論用哪種方法判定結(jié)果，每次都要有陽(yáng)性和陰性參考血清作對(duì)照，這樣可以消除一些外界的影響因素。
≤0.04“±” 0.06～0.092和0.08～0.25“+”
0.26～0.5“++” 0.51～1.0“+++” > 1.0“++++”
（九）試驗(yàn)的重復(fù)性（度），有二種方法來(lái)檢驗(yàn)試驗(yàn)的度：通常用變異系數(shù)來(lái)表示：1、幾個(gè)樣品用ELISA法同時(shí)進(jìn)行多次測(cè)定求出CV%；2、不同時(shí)間對(duì)不同操作者對(duì)某幾個(gè)樣進(jìn)行多次測(cè)定求出變異系數(shù)。CV是個(gè)體參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比率。
S / X ＝ CV ，CV應(yīng)低10%，不應(yīng)大于10～15%。
不論目測(cè)或分光光度計(jì)測(cè)定，均可作一個(gè)稀釋度或一系列稀釋度測(cè)定，一般常規(guī)診斷只用一個(gè)稀釋度判斷陽(yáng)性或陰性就可以了，這樣比較方便，現(xiàn)在推薦傳染病的血清診斷用1：200一個(gè)稀釋度。有些需要定量的，可作一系列稀釋度測(cè)定。
記錄結(jié)果有下列幾種方法：
1、“+”或“-”：所有超過(guò)規(guī)定的O.D值（如O.D，0.4）的標(biāo)本均屬陽(yáng)性，此規(guī)定O.D值是根據(jù)事先測(cè)定大量陰性標(biāo)本所取得的，此規(guī)定值是陰性標(biāo)本的上限?；蛘咭砸唤M陰性標(biāo)本O.D平均值加2～3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為陽(yáng)性閾值。
2、直接以O(shè).D值來(lái)表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)，但此數(shù)值是在固定實(shí)驗(yàn)條件下得到的結(jié)果，而且每次實(shí)驗(yàn)都要有參考標(biāo)本作對(duì)照。
3、以終點(diǎn)滴度表示：將標(biāo)本作連續(xù)稀釋，zui高稀釋度能出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)者（即OD值仍大于陽(yáng)性閾值，即為該標(biāo)本的滴度。
4、以“比值”表示：求出被檢標(biāo)本的O.D值與一組陰性標(biāo)本O.D值的比值，例如為陰性標(biāo)本的2倍或3倍，即為陽(yáng)性，比值小于2.1而大于1.5為可疑，<1.5為陰性。
測(cè)定標(biāo)本O.D值-空白O.D值
—————————————≥2.1
陰性對(duì)照O.D值-空白O.D值
如在此測(cè)定時(shí)以空白校正“O”點(diǎn)。
5、以“單位”來(lái)表示：在測(cè)定被檢標(biāo)本的同時(shí)，再測(cè)定一個(gè)含已知單位數(shù)的陽(yáng)性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測(cè)后，以O(shè).D值為縱坐標(biāo)，單位數(shù)為橫坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以后可根據(jù)被檢標(biāo)本的O.D值，從曲線上找出相應(yīng)的單位數(shù)，再乘于血清的稀釋倍數(shù)，即可得出被檢標(biāo)本的單位數(shù)。
作試驗(yàn)時(shí)的陰性參考血清不要顯色，否則會(huì)對(duì)結(jié)果判斷帶來(lái)困難，特別在目測(cè)時(shí)，當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)本O.D值>2.0時(shí)，應(yīng)作適當(dāng)稀釋后再作測(cè)定。
（十）對(duì)使用儀器要求：所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用于酶結(jié)合和底物的吸管和容器一定要分開(kāi)。試劑要求標(biāo)準(zhǔn)化。
四、具體操作法
上面已經(jīng)把ELISA中各步驟的影響因素作了說(shuō)明，為了便于工作下面把ELISA的操作程序列于表1供參考：
表1：ELISA操作步驟
| 方法 步驟 | 間接法（測(cè)抗體） | 雙抗體夾心法 （測(cè)抗原） | 競(jìng)爭(zhēng)法（測(cè)抗原） | 抑制性測(cè)定法 |
| 1 | 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至zui適濃度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反應(yīng)板每個(gè)凹孔中,4℃過(guò)夜或37℃水浴2～3小時(shí),貯存冰箱 | 包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至zui適濃度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃過(guò)夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱 | 包被特異性抗體： 同左 | 包被抗原： 同左 |
| 2 | 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 3 | 加被檢標(biāo)本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0.2ml，37℃，作用1～2小時(shí) | 每凹孔加入0.2ml用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標(biāo)本，37℃作用1～2小時(shí)。 | 分2組,a組加酶標(biāo)記抗原和被檢抗原混合液0.2ml，另一組只加酶標(biāo)記抗原液0.2ml，37℃作用1～2小時(shí)。（混合液可作成不同稀釋度）。 | a組加參考抗體和被檢抗原混合液0.2ml，另一組加參考抗體與等量稀釋劑0.2ml，37℃作用1～2小時(shí)。 |
| 4 | 洗滌：重復(fù)2 | 同左 | 洗滌：同左 | 洗滌 |
| 5 | 加入酶結(jié)合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結(jié)合物0.2ml 37℃作用1～2小時(shí) | 加入0.2ml用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)記特異性抗體溶液，37℃作用1～2小時(shí)或由預(yù)試實(shí)驗(yàn)確定作用時(shí)間。 | | 各加入0.2ml抗參考抗體的酶結(jié)合物37℃作用1～2小時(shí) |
| 方法 步驟 | 間接法（測(cè)抗體） | 雙抗體夾心法 （測(cè)抗原） | 競(jìng)爭(zhēng)法（測(cè)抗原） | 抑制性測(cè)定法 |
| 6 | 洗滌：重復(fù)2 | 同左 | | 洗滌 |
| 7 | 加入0.2ml底物溶液于每個(gè)凹孔,（O.P.D或O.T），室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4ml底物加0.1ml終止劑）。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 8 | 加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2M檸檬酸0.05ml。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 9 | 觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（O.P.D用492nm）O.D值。 | 同左 | 用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定a、b兩組O.D值，并求出a、b、O.D值的差數(shù) | 同左 |
五、ELISA的應(yīng)用
ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。酶免疫試驗(yàn)（EIA）結(jié)合光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡可進(jìn)行抗原定位與結(jié)構(gòu)的研究，用酶標(biāo)記抗原或抗體結(jié)合免疫擴(kuò)散及免疫電泳可提高試驗(yàn)的敏感性。在實(shí)際應(yīng)用方面可作疾病的研究診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面密切相關(guān)。
檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當(dāng)，在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），對(duì)前者的敏感性已達(dá)到與放射免疫試驗(yàn)相當(dāng)?shù)乃?，但?duì)CEA檢查的敏感性較低，目前尚不能用于常規(guī)診斷,在傳染病的診斷方面正在日益擴(kuò)大，其中zui滿意的是用于檢查乙型肝炎表面抗原。國(guó)內(nèi)外已有ELISA檢測(cè)的商品供應(yīng)。尚有用于檢查霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿桿菌和破傷風(fēng)梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢查免疫抑制樣本中常見(jiàn)的白色念殊菌抗原，檢查樣本或病獸的糞便中的輪狀病毒，自樣本標(biāo)本中檢查甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細(xì)胞病毒等。還可用于植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用于測(cè)鉤體抗原及血吸蟲病的循環(huán)抗原等。在免疫化學(xué)方面可用于檢測(cè)白蛋白，免疫球蛋白的各種組份，也可用于檢測(cè)補(bǔ)體成份，如：ciq，還能用于檢測(cè)蛇毒。
檢查抗體方面：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲病的血清學(xué)診斷，亦開(kāi)始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲病方面，它用于對(duì)瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學(xué)診斷，這對(duì)人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。在病原微生物方面已用于檢查鏈球菌、沙門氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風(fēng)抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測(cè)定以及檢測(cè)斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體，可作診斷。對(duì)立克次氏體還可用以鑒別密切有關(guān)的種屬。也有用于檢查鸚鵡熱衣原體抗體的報(bào)導(dǎo)。試用于病毒抗體檢查報(bào)告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風(fēng)疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過(guò)目前常用的檢查方法。此外，還可用于鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。如能進(jìn)一步改進(jìn)方法用于檢查特異性IgM，可以作為早期診斷以及了解體內(nèi)有關(guān)抗原的清除情況。在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過(guò)敏的診斷，例如檢測(cè)各種過(guò)敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。
六、ELISA存在的問(wèn)題
從以上的簡(jiǎn)單介紹中可以看出，ELISA法由于本身所具備的*性，是一項(xiàng)很有發(fā)展前途的血清學(xué)診斷方法，而且應(yīng)用的領(lǐng)域也越來(lái)越廣泛。但是我們認(rèn)為ELISA不是萬(wàn)應(yīng)良方，用它來(lái)代替一切，這是不當(dāng)?shù)?。因?yàn)镋LISA法還有局限性：
1、由于ELISA所用的抗原大部分還是混合的可溶性抗原，所以對(duì)同一微生物寄生蟲或其他物質(zhì)不同部位的抗原還沒(méi)有分開(kāi)。
2、內(nèi)源性過(guò)氧化酶的普遍存在，如人腦組織中，呼吸道分泌物的炎癥細(xì)胞中及某些病毒的組織培養(yǎng)中均有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去時(shí)，則病毒的抗原性亦受到破壞，對(duì)于用ELISA檢測(cè)不利。
3、對(duì)ELISA法的非特異性評(píng)價(jià)的資料尚不夠完善，因此，對(duì)出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時(shí)候，往往不易解釋。
4、固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還不一致，致使不同批號(hào)的固相載體有時(shí)本底值較高，有時(shí)吸附性能很差，影響試驗(yàn)結(jié)果。
5、試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過(guò)海，各顯神通”，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。
下面將ELISA法與免疫熒光（IFA）和放射免疫（RIA）的各自優(yōu)缺點(diǎn)作一簡(jiǎn)要的比較（表4）,供參考:
表4:三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較:
| 方法種類 比較指標(biāo) | ELISA | RIA | IFA |
| 敏感性 | 高 | 高 | 較低 |
| 特異性 | 取決于抗原制備 | 同左 | 較高 |
| 重演性 | 尚滿意 | 尚滿意 | 尚滿意 |
| 結(jié)果判斷 | 客觀 | 客觀 | 有主觀因素 |
| 抗原制備 | 較容易或復(fù)雜 | 同左 | 較容易 |
| 結(jié)合物制備 | 正在標(biāo)準(zhǔn)化 | 已標(biāo)準(zhǔn)化 | 已標(biāo)準(zhǔn)化 |
| 在野外條件下用于大量人群標(biāo)本的普查 | 可以 | 困難 | 尚可以 |
| 分析自動(dòng)化 | 可以 | 可以 | 困難 |
| 主要設(shè)備 | 酶標(biāo)比色計(jì) | 粒子計(jì)數(shù)器 | 熒光顯微鏡 |
| 試驗(yàn)成本 | 低 | 高 | 較高 |
| 試劑半衰期 | 長(zhǎng) | 短 | 長(zhǎng) |
| 對(duì)人的危害性 | 無(wú)或很少 | 有 | 無(wú)或很少 |
| 主要檢測(cè)對(duì)象 | 抗體或抗原 | 抗原 | 抗原或抗體 |
| 應(yīng)用范圍 | 小的診斷實(shí)驗(yàn)室 | 大的中心實(shí)驗(yàn)室 | 小的診斷試驗(yàn)室 |
綜上所述，ELISA在國(guó)內(nèi)外已使用得非常廣泛，但對(duì)該法在應(yīng)用中的評(píng)價(jià)尚不一致，過(guò)去在ELISA法開(kāi)始建立時(shí)有全面肯定的趨勢(shì)，而在廣泛研究和實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)了一些缺點(diǎn)，遇到了一些困難，如在重演性問(wèn)題、特異性問(wèn)題以及能否考核療效問(wèn)題等等。所以在70年代末期也有人采取否定的態(tài)度，全面肯定或全盤否定，這些都是不正確的，對(duì)一種新方法的建立和深入研究，要采取一分為二的方法加于評(píng)價(jià)，既要看到方法的優(yōu)點(diǎn)，也要重視存在的問(wèn)題，便于進(jìn)一步研究加以克服。世界衛(wèi)生組織專家組提出對(duì)ELISA的評(píng)價(jià)認(rèn)為：“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用是一個(gè)好辦法，但要做好它不容易。”因此，還需進(jìn)一步研究改進(jìn)，加以完善。從而使之成為對(duì)多種疾病診斷較為理想的方法是*可能的。
更新時(shí)間：2013-05-27 
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